液相色譜法--常見故障排除指南
更新時(shí)間：2020-12-21 瀏覽次數(shù)：2471
高效液相色譜(HPLC)廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥衛(wèi)生、食品安全、環(huán)境化學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域。在使用過程中難免會(huì)遇到各種各樣的問題，從而影響正常工作，如何快速發(fā)現(xiàn)故障、排除故障，并做好預(yù)防維護(hù)措施及其重要，本文列舉了常見故障的排除及解決方法，僅供大家參考。
故障排除原則
在儀器序列運(yùn)行過程中發(fā)生故障時(shí)按發(fā)現(xiàn)故障、停止儀器序列運(yùn)行、故障信息登記、確認(rèn)故障來源、解除故障、故障維修登記、做好預(yù)防維護(hù)措施等步驟進(jìn)行故障排查及解除故障，在故障排除過程中可遵循以下原則：
原則一：從簡單因素入手；
原則二：一次只變化一個(gè)因素，利于確認(rèn)因素與問題之間的關(guān)系；
原則三：記錄儀器正常狀態(tài)的參數(shù)及異常狀態(tài)信息，完整的記錄是故障排除的關(guān)鍵步驟；
原則四：做好預(yù)防措施，加強(qiáng)儀器操作培訓(xùn)，正確的、良好的操作習(xí)慣是降低儀器故障率的首要條件。
常見故障排除
1、壓力高
壓力偏高或超過壓力上限一般是由方法問題、誤操作、系統(tǒng)堵塞、壓力傳感器故障等問題引起。
方法問題：在方法建立時(shí)柱溫、流速等參數(shù)建立不當(dāng)，當(dāng)使用小粒徑色譜柱或背壓大的色譜柱時(shí)，可降低流速或升高柱溫（如35～40℃），以降低系統(tǒng)壓力，該問題多發(fā)生在建立方法時(shí)。
誤操作：當(dāng)壓力高于平時(shí)壓力時(shí)首先檢查柱溫是否設(shè)置錯(cuò)誤、流動(dòng)相溶劑是否使用錯(cuò)誤（如錯(cuò)將甲醇用成了粘度高的乙腈）、色譜柱是否拿錯(cuò)等誤操作。
系統(tǒng)堵塞：排除方法問題及誤操作后，排查是否系統(tǒng)堵塞，進(jìn)行分段排查，可依次松開管路接頭，從HPLC出口端開始，向上游泵逐個(gè)檢查，這是發(fā)現(xiàn)堵塞部位簡單的方法，確定堵塞部位后可進(jìn)行直接更換、或超聲清洗、或反沖（如六通閥、進(jìn)樣針、針座、管路等部位），如超聲清洗或反沖無效則需更換，經(jīng)排查是保護(hù)柱或色譜柱堵塞時(shí)按相關(guān)方法沖洗。
壓力傳感器故障：上述排查后未發(fā)現(xiàn)壓力高原因，則需要更換壓力傳感器，聯(lián)系儀器客服咨詢。
2、壓力低
壓力偏低或無壓力一般是由誤操作、漏夜、泵不輸液等問題引起。
誤操作：泵關(guān)閉、打開了排空閥等誤操作引起無壓力、柱溫設(shè)置錯(cuò)誤、用錯(cuò)溶劑、用錯(cuò)色譜柱等誤操作可能導(dǎo)致壓力偏低或偏高。
漏夜：壓力偏低或無壓力很多時(shí)候是由漏夜引起，配有漏夜感應(yīng)器先確認(rèn)哪個(gè)模塊漏夜報(bào)錯(cuò)（此時(shí)已經(jīng)嚴(yán)重漏夜），清除錯(cuò)誤后重新啟動(dòng)泵排查該模塊漏夜位置（用濾紙或紙巾逐個(gè)接口試漏），未配有漏夜感應(yīng)器或輕微漏夜時(shí)由泵至檢測器逐個(gè)接口排查（漏夜多發(fā)生在色譜柱接口及泵各接口）。確定漏夜位置根據(jù)漏夜原因進(jìn)行處理，如接口松動(dòng)重新擰緊、如密封圈磨損更換密封圈等。
泵不輸液：流動(dòng)相走空、管路中有空氣、未充分排空、溶劑入口過濾頭堵塞、單向閥污染均可能引起泵不輸液。首先檢查溶劑瓶內(nèi)是否有溶劑、管路中是否充滿氣體，進(jìn)行排空（如排空廢液口無液體流出使用注射器手動(dòng)抽，至有連續(xù)液體流出）；排空后依然無壓力、壓力偏低或壓力波動(dòng)，且廢液口無廢液流出，超聲清洗單向閥或更換單向閥，無改善將溶劑入口過濾頭取下，查看壓力是否正常，如濾頭堵塞超聲清洗或更換（注：安捷倫溶劑入口過濾頭為陶瓷材質(zhì)，不可以超聲，使用1%～10%硝酸浸泡過夜）。
3、壓力波動(dòng)
排氣不充分或未排氣、脫氣機(jī)未開或故障、流動(dòng)相中溶劑不互溶或易揮發(fā)、溶劑入口過濾頭部分堵塞、單向閥污染、漏夜等均可導(dǎo)致壓力波動(dòng)。
排空不充分或未排空：發(fā)現(xiàn)壓力波動(dòng)首先進(jìn)行流動(dòng)相排空，一般排空后壓力正常。
脫氣機(jī)未開或故障：外置脫氣機(jī)檢查電源是否打開或報(bào)錯(cuò)（如安捷倫1100、1200，島津20AT、20AD為外置脫氣機(jī)）；內(nèi)置脫氣機(jī)檢查泵是否有報(bào)錯(cuò)信息（如安捷倫1260等為內(nèi)置脫氣機(jī)）；waterse2695為內(nèi)置脫氣機(jī)在控制面板可以控制脫氣機(jī)開關(guān)，需檢查開關(guān)是否打開，壓力是否小于1psi。
流動(dòng)相中溶劑不互溶或易揮發(fā)：檢查緩沖鹽稱量是否正確、是否混合均勻，檢查溶劑是否互溶。
溶劑入口過濾頭部分堵塞：查看溶劑入口過濾頭周圍是否有大量氣泡，如果有大量氣泡可能過濾頭較臟，超聲清洗，安捷倫陶瓷濾頭用久了會(huì)變黑，取下1%～10%硝酸浸泡過夜。
單向閥污染：如排空后壓力波動(dòng)依然較大，取下單向閥超聲清洗，多數(shù)情況可以解決。
漏夜：多數(shù)為柱塞桿密封圈磨損導(dǎo)致漏液，配有在線清洗時(shí)檢查在線清洗液是否有明顯增加（清洗液循環(huán)使用的），查看在線清洗管路出口端，在未清洗時(shí)是否有液體緩慢流出，如有液體流出說明，柱塞桿密封圈磨損導(dǎo)致漏液，更換密封圈或柱塞桿及密封圈。
4、保留時(shí)間變動(dòng)
如果所有峰（色譜峰）的保留時(shí)間均發(fā)生了變化，其原因很可能是流動(dòng)相的組成、色譜柱的化學(xué)性質(zhì)、色譜柱的溫度或流速、在線混合時(shí)比例閥故障等。
流動(dòng)相的組成：如果操作人員操作不當(dāng)，則會(huì)導(dǎo)致流動(dòng)相組成的意外變化，例如使用在線式混合系統(tǒng)時(shí)，流動(dòng)相混合物（系統(tǒng)）設(shè)置不正確；或替換新批次流動(dòng)相時(shí)，未妥善制備新的流動(dòng)相（新流動(dòng)相配制不正確）。在極少數(shù)情況下，會(huì)出現(xiàn)流動(dòng)相組分選擇性損失的情況，例如蒸發(fā)。
當(dāng)流動(dòng)相發(fā)生變化時(shí)，峰形（色譜峰）通常會(huì)向相同的方向移動(dòng)，以縮短或延長保留時(shí)間（保留時(shí)間變長或變短）；而相對保留通常會(huì)發(fā)生變化。檢查流動(dòng)相組成錯(cuò)誤的較佳方法是仔細(xì)檢查（復(fù)查）系統(tǒng)設(shè)置；如有必要，應(yīng)制備新的流動(dòng)相。
如果您懷疑設(shè)備出現(xiàn)故障，請將色譜柱和流動(dòng)相移至另一個(gè)HPLC系統(tǒng)，然后再次運(yùn)行。如果問題依然存在，則問題在于流動(dòng)相或色譜柱；如果問題不再出現(xiàn)，則可能與儀器硬件故障或參數(shù)相關(guān)。
色譜柱化學(xué)（化學(xué)性質(zhì)）變化：一般會(huì)在色譜柱使用數(shù)周或數(shù)月內(nèi)逐漸變化。柱老化一般伴隨著柱背壓的上升、保留時(shí)間的逐漸變化（漂移）（更長或更短）以及更多的峰拖尾。更換新柱以確定是否是柱老化導(dǎo)致的保留時(shí)間變動(dòng)。
色譜柱溫度變化：柱溫變化會(huì)導(dǎo)致保留時(shí)間的變化，每1℃的溫度變化會(huì)引起1-3％的保留時(shí)間變化。如果不使用柱溫箱（即“室溫”條件），實(shí)驗(yàn)室溫度通常會(huì)變化。尤其是當(dāng)供暖或空調(diào)通風(fēng)口直接吹向系統(tǒng)時(shí)，溫度變化極為明顯。使用柱溫箱可以避免色譜柱出現(xiàn)這樣的溫度問題，且HPLC系統(tǒng)應(yīng)遠(yuǎn)離通風(fēng)口放置。
流速變化：可能是因存在氣泡、泄漏或泵問題（故障）導(dǎo)致流速與設(shè)定值發(fā)生變化，導(dǎo)致保留時(shí)間變化。
氣泡問題：可能伴有柱壓過低或柱壓波動(dòng)，且保留時(shí)間延長。對于雙頭泵，如果只有一個(gè)泵頭存在氣泡，則流量和壓力可能會(huì)發(fā)生脈動(dòng)。
泄漏也會(huì)延長保留時(shí)間。查看接頭如有液滴或結(jié)晶析出，可證明有泄露。請?zhí)貏e注意色譜柱之前的接頭。如果使用不銹鋼配件，通常將接頭螺母手動(dòng)擰緊，再扳手?jǐn)Q緊1/4圈，便可以阻止泄漏。使用PEEK接頭時(shí)，應(yīng)停止泵，松開接頭，將管路推到接口端口的底部，再擰緊接頭。擰緊PEEK接頭時(shí)如果存在流動(dòng)的液體，會(huì)導(dǎo)致管道在配件中滑動(dòng)，產(chǎn)生柱外死體積，進(jìn)而影響分離效果。
單向閥污染或泵密圈磨損會(huì)導(dǎo)致流量偏低或波動(dòng)，從而導(dǎo)致保留時(shí)間變化。單向閥污染可以進(jìn)行超聲清洗，隨著使用時(shí)間的增加，泵密封圈會(huì)出現(xiàn)磨損，而且使用高濃度緩沖鹽為流動(dòng)相，會(huì)縮短泵密圈的使用壽命，可以根據(jù)使用情況及密封圈故障率定期更換密封圈，通常一年更換一次即可。
比例閥和在線混合發(fā)生故障會(huì)降低梯度洗脫的效果，從而導(dǎo)致保留時(shí)間變化，下面介紹了一種檢查流動(dòng)相配比精度的簡單方法：將色譜柱柱更換為0.005英寸直徑約1米長（0.12mm）的管道，流動(dòng)相A為水，流動(dòng)相B為0.1％丙酮的水，檢測器波長設(shè)置為265nm，并使用足夠高的流速使單向閥能夠有效工作（例如2mL/min）。以10％為增量進(jìn)行梯度變化（如流動(dòng)相B由10％、20％、30％……90％至100％）。其結(jié)果應(yīng)是平滑的階梯狀。
5、峰形問題
峰形常見問題有拖尾峰、伸舌峰、分叉峰、鬼峰等。
拖尾峰：
（1）堿性化合物與硅膠顆粒表面上的酸性或離子化硅烷醇基團(tuán)之間相互作用而導(dǎo)致拖尾，選擇經(jīng)封端處理的色譜柱、添加掃尾劑如三乙胺，可以改善拖尾。
（2）緩沖液或離子對試劑濃度低也會(huì)導(dǎo)致峰拖尾，緩沖液主要用來使樣品保持恒定的離子化狀態(tài)，從而穩(wěn)定保留時(shí)間，并在較大程度上減少因離子相互作用而導(dǎo)致的峰拖尾現(xiàn)象。緩沖液和離子對試劑的一個(gè)共同特征是作用效果（例如峰拖尾的減少、保留時(shí)間的穩(wěn)定）會(huì)從低濃度開始顯現(xiàn)，并隨著濃度的增加而繼續(xù)作用增加，但會(huì)逐漸維持在一個(gè)穩(wěn)定水平。穩(wěn)定水平之下的緩沖鹽或離子對濃度，可以保持穩(wěn)定的運(yùn)行；濃度過高可能導(dǎo)致溶解性問題，新藥特別注意。
（3）柱篩板堵塞引起峰拖尾或變形：柱篩板堵塞會(huì)影響樣品在色譜柱入口端的分流，使得部分樣品通過不同的流動(dòng)路徑到達(dá)色譜柱，因此會(huì)晚于另一部分樣品。由于此時(shí)未發(fā)生分離，因此所有分析物會(huì)以相同的方式變形（被擾亂），進(jìn)而色譜圖顯示所有峰均具有相似（類似）的峰拖尾或變形。
（4）死體積過大：當(dāng)相同方法轉(zhuǎn)移至其它儀器時(shí)出現(xiàn)色譜圖中所有峰拖尾或變形可以排查是否死體積增大導(dǎo)致，管路長度、內(nèi)徑、接口處是否擰緊均可改變死體積。
伸舌峰（前拖峰）：
伸舌峰一般是由柱過載、柱結(jié)構(gòu)塌陷、接口處死體積渦流、樣品溶劑與流動(dòng)相不兼容、柱溫低等因素導(dǎo)致的。柱過窄、樣品溶劑與流動(dòng)相不兼容、柱溫低等因素產(chǎn)生的伸舌峰一般發(fā)生在方法開發(fā)期間，需要篩選適合的柱溫、稀釋劑及進(jìn)樣濃度；穩(wěn)定的方法忽然出現(xiàn)伸舌峰需要排查色譜柱是否塌陷及管路接口處是否對接緊密，特別注意色譜柱接口處，接口處的死體積容易產(chǎn)生渦流，導(dǎo)致伸舌峰。
分叉峰：
（1）色譜柱或保護(hù)柱入口端污染：如安裝保護(hù)柱可不接保護(hù)柱或更換新的保護(hù)柱來排除，再更換新的色譜柱進(jìn)行排除，確認(rèn)是色譜柱污染，進(jìn)行沖洗，沖洗無效，對色譜柱進(jìn)行再生或更換色譜柱。
（2）篩板堵塞：關(guān)注色譜柱壓力，如高于之前的壓力，可能篩板堵塞，反沖色譜柱或更換色譜柱排查。
（3）樣品稀釋劑與流動(dòng)相不兼容：在方法開發(fā)其間出現(xiàn)分叉峰時(shí)需要排查稀釋劑與流動(dòng)相的兼容性，建議選擇流動(dòng)相作為稀釋劑，在日常檢測中需要排查是否用錯(cuò)稀釋劑。
（4）干擾峰：可能是樣品中純在的物質(zhì)與目標(biāo)物為分離，需要調(diào)節(jié)方法（調(diào)節(jié)流動(dòng)相或更換色譜柱）改變選擇性，可能是系統(tǒng)中引入的污染物，通過空白溶液可以排查。
（5）色譜柱過載：選擇高容量的色譜柱或降低進(jìn)樣濃度。
鬼峰：主要來源于溶劑污染（包括流動(dòng)相、稀釋劑等）、色譜柱污染、進(jìn)樣器污染、氣泡、配樣污染（移液、定容等過程）、上針殘留等，如鬼峰出現(xiàn)在空白溶液，且多針重現(xiàn)，可通過進(jìn)空針、更換洗針液、更換色譜柱、更換儀器、重配流動(dòng)相等篩選引起鬼峰位置；如鬼峰出現(xiàn)在樣品溶液中，可能是上針殘留、氣泡、及配樣污染。